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富含共軛亞油酸核桃發(fā)酵乳的研制

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• 富含共軛亞油酸核桃發(fā)酵乳的研制

  柴云美，馬青雯，和怡，許麗珍，黃艾祥^*

  云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，云南昆明  650201

  摘要：共軛亞油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是亞油酸的一種異構(gòu)體，具有減肥、抗癌、抗動脈粥樣硬化等生理功能。本研究以課題組前期篩選的高產(chǎn)CLA的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum，L1）為基礎，以核桃油為底物，研發(fā)一款富含CLA的發(fā)酵乳。通過十字交叉劃線法發(fā)現(xiàn)Lactobacillus fermentum L1與保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus,Lb）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus,St）均不存在拮抗關系。將添加了不同量核桃仁和核桃油的牛奶按照L1：Lb：St=2:1:1比例發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)核桃油發(fā)酵乳的CLA含量（151.62～215.94μg/mL）均高于核桃仁發(fā)酵乳的CLA含量（76.08～147.99μg/mL）。為進一步提高核桃油發(fā)酵乳中CLA含量，通過響應面優(yōu)化實驗得到最佳工藝條件（接種量為6%，核桃油添加量為9%，培養(yǎng)溫度為40℃，培養(yǎng)時間為28h）。最佳工藝條件下制備的發(fā)酵乳感官評分達90.35，活菌數(shù)達lg 8.0 CFU/mL，CLA含量可達225.56μg/mL，其余各項指標良好。本研究為核桃發(fā)酵乳及富含CLA的發(fā)酵食品的研制提供了理論依據(jù)。

  關鍵詞：共軛亞油酸；核桃；發(fā)酵乳

   

  Development of walnut fermented milk rich in conjugated linoleic acid

  CHAI Yunmei，MA Qingwen，HE Yi，XU Lizhen，HUANG Aixiang^*

  College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming,Yunnan 650201

  Abstract：Conjugated linoleic acid (CLA) is an isomer of linoleic acid, which has physiological functions such as weight loss, anti-cancer, and anti-atherosclerosis. This research is based on the Lactobacillus fermentum (L1), which is high-yielding CLA, selected by the research group in the early stage, and uses walnut oil as a substrate to develop a CLA-rich fermented milk. There is no antagonistic relationship between Lactobacillus fermentum (L1) and Lactobacillus bulgaricus (Lb) and Streptococcus thermophilus (St) by the cross-hatch method. Different amounts of walnut kernels and walnut oil were added to the milk, and fermented according to the ratio of L1:Lb:St=2:1:1. The results of the study found that the CLA content of walnut oil fermented milk (151.62～215.94μg/mL) was higher than that of walnut kernel (76.08～147.99μg/mL).In order to further improve the content of CLA in walnut oil fermented milk, optimal process conditions (the inoculation amount was 6%, the addition amount of walnut oil was 9%, the culture temperature was 40℃and the culture time was 28 h )was obtained by the response surface optimization experiment. The sensory score of fermented milk prepared under the optimal process conditions reached 90.35, the number of viable bacteria reached lg 8.0 CFU/mL, the content of CLA reached 225.56 μg/mL, and the other indicators were good.This research provides a theoretical basis for the development of walnut fermented milk and fermented foods rich in CLA.

  Key words: conjugated linoleic acid (CLA); Walnut; Fermented milk

  1 前言

  發(fā)酵乳因富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物元素、易于消化吸收等特點而深受消費者的喜愛^[1]。隨著生活水平的不斷提高，人們對食物的需求由最初的“吃得飽”轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>“吃得好”，因此功能性食品應運而生。共軛亞油酸（Conjugated linoleic acids, CLA）作為食物中的天然成分，在奶及奶制品^[2]、肉制品^[3]等食品中被發(fā)現(xiàn)。CLA由于具有抗癌^[4]、預防動脈粥樣硬化^[5]、和減肥^[6]等生理功能^[7]，近年來被作為保健品投放市場，在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)中應用前景廣闊，引起人們的廣泛關注^[8]。人體自身無法合成CLA，只有通過攝取食物來進行補充^[9]。目前人們主要從乳制品和肉制品中獲取CLA，但乳制品和肉制品中CLA的含量較低，無法滿足人們營養(yǎng)健康需求。據(jù)報道乳酸菌可以大量轉(zhuǎn)化生成CLA^[10],而核桃富含營養(yǎng)物質(zhì)且亞油酸占不飽和脂肪酸的58%^[11]，以核桃為底物可為未來大量獲取CLA的一個重要的途徑^[12]。核桃是云南省的重要種植作物，核桃資源豐富、歷史悠久、栽種地域范圍廣闊。將核桃制作成不同的產(chǎn)品，如核桃乳、核桃油、核桃粉等，可減小農(nóng)產(chǎn)品滯銷帶來的風險，保障農(nóng)民勞動成果，增加農(nóng)民的收益^[13]。

  
  

  本研究以Lactobacillus fermentum L1、Lactobacillus bulgaricus、Streptococcus thermophilus為發(fā)酵劑，核桃仁、核桃油為底物，研制了一款富含CLA的核桃發(fā)酵乳。

  
  

  2 材料與方法

  2.1 材料

  2.1.1菌種

  嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus，St），保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus, Lb），發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentansL1。

  2.1.2 原料與試劑

  Man Rogosa Share（MRS）培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基均購自Sigma 公司；孟加拉紅培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；核桃油，云南金江綠色產(chǎn)業(yè)有限公司；干核桃，昆明宗澳商貿(mào)有限公司。

  2.2 儀器設備

  SW-CJ-IF單人雙面超凈無菌操作臺, 蘇州江東精密儀司; STB-505榨油機, 上海精密科學儀器有限公司; TGL2M臺式高速冷凍離心機, 長沙邁佳森儀器設備有限公司; UV-1800CP紫外分光光度計, 上海美譜達儀器有限公司。

  2.3實驗方法

  2.3.1 菌種活化

  將保藏于-80℃ 冰箱的L1，St和Lb在MRS瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)(37℃, 24h)，從平板上挑取單一菌落至MRS 肉湯培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24h，活化至第三代備用。

  2.3.2 菌種共生關系研究

  在平板上采用十字交叉劃線研究L1， St和Lb間是否存在拮抗關系。

  2.3.3菌種馴化

  將活化至第三代的L1，以逐步減少接種量（10%、8%、6%、4%）的方法進行逐級馴化。將傳至第三代的St和Lb，分別與牛奶以1:1的比例混合均勻，于40℃培養(yǎng)至凝乳后即完成馴化。

  2.3.3兩種類型核桃發(fā)酵乳的制作

  2.3.3.1原料乳制備

  （1）核桃仁原料乳制備：采用食品級NaOH在80℃處理5min后進行去皮，用小型粉碎機粉碎并過100目篩篩分。將核桃顆粒和脫脂乳以3%（g/v）、5%（g/v）、8%（g/v）、10%（g/v）的比例混合后進行巴氏滅菌（60～80℃，30min）。

  （2）核桃油原料乳制備：將單甘脂、蔗糖脂按照0.3%（g/g）的比例與核桃油混合，用打蛋器攪打制備乳化液。將核桃油乳化液加入脫脂乳中，配制成核桃油含量為3%（g/v）、5%（g/v）、8%（g/v）、10%（g/v）的原料乳。原料乳經(jīng)膠體磨處理三次，每次2min，高壓均質(zhì)機均質(zhì)三次，壓力為18 MP，均質(zhì)結(jié)束后進行巴氏滅菌（60～80℃，30min）。

  2.3.3.2發(fā)酵乳制備

  將L1: St: Lb=2:1:1比例以2%（v/v）的接種量分別接入滅菌好的核桃仁、核桃油原料乳中，并于37℃下培養(yǎng)24h后放入4℃冰箱中后熟12h。

  2.3.3.3發(fā)酵乳CLA含量的測定

  參照朱振元等的方法^[16]，略作調(diào)整，在分液漏斗中加入10mL發(fā)酵乳、30mL水、30 mL正己烷中振蕩萃取，靜置20 min后再加入30 mL正己烷進行第二次萃取，其他步驟同上進行3次萃取，加入150 ml的水靜置2 h，棄去下層液體，收集上層正己烷層即為萃取液，加入少量無水硫酸鈉吸水干燥萃取液用0.22 μm濾膜過濾后移至10 mL的容量瓶，之后用紫外分光光度計進行檢測。以未接種的發(fā)酵乳為參比，在232 nm（CLA 最大吸收波長）下測定萃取液吸光度。并根據(jù)公式y=0.0781x-0.0508（R²=0.9993）計算CLA含量。

  2.3.4單因素試驗

  以CLA的產(chǎn)量為指標，通過單因素試驗分別考察接種量（3%、4%、5%、6%、7%）、核桃油添加量（3%、6%、8%、10%）、培養(yǎng)溫度（30 ℃ 、35 ℃ 、38 ℃、40℃、42℃）及培養(yǎng)時間（20 h、24 h、26 h、28 h、30 h）對CLA產(chǎn)量的影響。

  2.3.5 響應面試驗設計

  綜合產(chǎn)CLA含量的各單因素試驗結(jié)果，選取接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和底物添加量為響應面分析試驗因素，分別以A、B、C、D表示，試驗因素和水平設計見表1，使用Design-Expert軟件進行Box-Behnken設計。

   

  

  2.4成品理化指標檢測

  參照GB4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗-菌落總數(shù)測定》^[14]測定活菌數(shù)，參照GB 5413.34-2010《食品安全國家標準乳和乳制品酸度測定》^[15]測定滴定酸度。

  2.5發(fā)酵乳的感官評價

  
  

  感官鑒定發(fā)酵乳，如下表2內(nèi)容，觀察發(fā)酵乳的色澤、質(zhì)地、滋味，同時留意異味、雜質(zhì)、沉淀等情況。

  

  3 結(jié)果與分析

  3.1共培養(yǎng)對菌種活性的影響

  由圖1可知， L1分別與St（左）和Lb（右）交叉劃線后，交叉劃線區(qū)域未出現(xiàn)抑菌現(xiàn)象，說明菌種間不存在抑制。研究結(jié)果與張璐^[18]、蔣欣容^[19]的實驗結(jié)果一致，說明菌株可以共同生產(chǎn)發(fā)酵乳。

   

  
  

  3.2菌種馴化后凝乳活力

  菌種經(jīng)過馴化后的凝乳情況見表3所示。St和Lb菌種經(jīng)過在牛奶中馴化后凝乳時間由6h縮短至了4h，菌落總數(shù)均在lg 7.0 CFU/mL以上，滴定酸度均在70 oT以上，凝乳后有少量的乳清析出；L1經(jīng)馴化后凝乳時間得到明顯的改善，由未馴化時的28h凝乳縮短至了6h，菌落總數(shù)均在lg 6.5 CFU/ mL以上，滴定酸度接近70 oT，發(fā)酵凝乳后無乳清析出。菌株經(jīng)馴化后縮短了凝乳時間的結(jié)果與李轉(zhuǎn)羽等^[20]的研究相似，說明菌株經(jīng)過馴化后適應了在牛奶中的生長環(huán)境，從而明顯的提高了菌株活力縮短了凝乳時間。

   

  

  3.3 兩種類型核桃發(fā)酵乳的CLA含量比較

  

  
  

  兩種類型核桃發(fā)酵乳CLA含量如圖2所示。隨著底物添加量的增加（3%~10%），核桃油發(fā)酵乳與核桃仁發(fā)酵乳的CLA含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，核桃油發(fā)酵乳的CLA含量（151.62～215.94 μg/mL）高于核桃仁的CLA含量（76.08～147.99 μg/mL），當添加量為8%時CLA含量最高。出現(xiàn)這個結(jié)果的原因可能是亞油酸是乳酸菌產(chǎn)生CLA的底物，據(jù)報道核桃仁中生成CLA的前體物質(zhì)亞油酸的含量（60.3%）^[21]低于核桃油中的亞油酸的含量（80. 21%）^[22]。故在后續(xù)實驗中，以核桃油為底物進行研究。

  3.4發(fā)酵條件優(yōu)化

  3.4.1接種量對共軛亞油酸含量的影響

   

  

  
  

  菌株不同接種量對發(fā)酵乳產(chǎn)生CLA含量的影響如圖3所示。隨著接種量的增加（3%~7%），CLA含量呈先增加后減少的趨勢，接種量為6%時CLA含量最高（199.64 μg/mL）；接種量高于6%時，發(fā)酵乳的CLA含量開始下降。本試驗與于田等^[23]人的試驗結(jié)果相一致，原因主要是接種量的多少會影響菌體的生長速度，剛開始隨著接種量的增加，菌體生長旺盛，新陳代謝快，CLA合成量增大。

  3.4.2 底物添加量對共軛亞油酸含量的影響

  

  
  

  由圖4可知，底物添加量在3%～8%范圍內(nèi)時，CLA含量隨著底物添加量的增加而增加。底物添加量為8%時CLA含量達到最高（216.15 μg/mL），而高于8%時CLA含量。本研究結(jié)果與金磊等^[24]的結(jié)果一致，原因主要是異構(gòu)酶異構(gòu)化亞油酸含量，與底物亞油酸添加量有關，底物添加量少，所以CLA合成就少，隨著底物添加量增加，CLA的合成量也逐漸增大；當濃度高于一定值時，菌株將無法利用底物，CLA合成減少^[25]。

  3.4.3培養(yǎng)溫度對共軛亞油酸含量的影響

   

  

  
  

  培養(yǎng)溫度對發(fā)酵乳CLA含量的影響如圖5所示。當發(fā)酵溫度為30℃～42℃時， CLA的合成量呈先增加后減少的趨勢。溫度為40℃時CLA產(chǎn)量達到最高（213.23 μg/mL），當溫度高于40℃時，CLA含量開始下降。本研究結(jié)果與張麗莉^[26]的研究結(jié)果一致，菌株發(fā)酵時溫度過低，將會導致菌株出現(xiàn)休眠狀態(tài)；發(fā)酵溫度過高，導致乳酸菌未進行發(fā)酵就死亡。

  3.4.4 培養(yǎng)時間對共軛亞油酸含量的影響

   

  

   

  培養(yǎng)時間對發(fā)酵乳中的CLA含量的影響如圖6所示。由圖6可知，發(fā)酵乳在培養(yǎng)20 h～28 h時CLA的含量持續(xù)增高 (85.56 μg/mL～212.06 μg/mL)，培養(yǎng)時間超過28h后CLA開始降低。產(chǎn)生此結(jié)果的原因主要是隨著培養(yǎng)時間的延長，由于共軛雙鍵的不穩(wěn)定性，不飽和脂肪酸最終被還原成飽和或單不飽和脂肪酸^[27]_。

  3.5響應面試驗優(yōu)化發(fā)酵條件

  3.5.1響應面試驗設計及結(jié)果

  根據(jù)單因素實驗結(jié)果，建立Box-Behnken Design中心組合設計，Box-Behnken Design中心組合設計的原理是以CLA含量為響應值，接種量（A）、培養(yǎng)溫度（B）、培養(yǎng)時間（C）及底物添加量（D）為因素，通過建立數(shù)學模型，來獲得最佳發(fā)酵條件。表4為響應面實驗設計方案及結(jié)果。

   

   

  3.5.2建立模型及顯著性檢驗

  利用Design-Expert8.0.6軟件對表6進行多元回歸擬合，得到的二次方程模型為：Y=+220.89+2.20* A-3.64* B+1.65* C+7.84* D-19.37* A2-13.37* B2-18.32* C2-14.60* D2+2.20* A * B+4.70* A * C-1.47* A * D-1.17* B * C+1.27* B * D+7.87* C * D。回歸模型的方差分析結(jié)果見表5。

   

  

  由5可知，所建立模型的P＜0.000 1，顯著；失擬項P＞0.05，不顯著，表明模型具有較高可靠性；調(diào)整決定系數(shù)R²=0.9757，信噪比Adeqprecisior=19.948也從另一個方面表明此模型是可靠的。經(jīng)方差分析，3個因素對富含共軛亞油酸核桃發(fā)酵乳影響的主次順序為D＞B＞A＞C，即底物添加量＞發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時間。

  3.5.3響應面分析

  當響應面呈現(xiàn)為馬鞍形時表示交互作用顯著^[28]。如圖7所示，說明接種量與培養(yǎng)時間、培養(yǎng)時間與底物添加量之間的交互作用明顯，且對響應值的影響較為顯著，與方差分析結(jié)果有著較好的一致性。

   

  
  

  3.5.4最佳發(fā)酵條件的確定和回歸模型的驗證

  對回歸方程進行逐步回歸，確定最佳工藝參數(shù)：6.05%菌種接種量，39.66℃的發(fā)酵溫度，28.25h的發(fā)酵時間，8.95%的底物添加量，CLA含量評分預測值為222.42μg/mL。為了切合實際操作情況，確定發(fā)酵乳最佳發(fā)酵工藝為：6.00%菌種接種量，40.00℃的發(fā)酵溫度，28.00h的發(fā)酵時間，9.00 %的底物添加量。在上述最佳條件下進行驗證，得到發(fā)酵乳CLA的最佳含量為225.56 μg/mL，與理論值接近。

  3.6富含CLA發(fā)酵乳的品質(zhì)特性

  3.6.1理化和微生物指標測定

   

  

  由表6可知，非脂乳固體（8.73 μg/mL±0.54）、蛋白質(zhì)（3.94±0.20）、酸度（71.81±1.28）的檢出量均符合國標的規(guī)定；大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、酵母和霉菌均未檢出，乳酸菌的活菌數(shù)也符合國標要求，表明產(chǎn)品符合質(zhì)量標準。

  3.6.2 富含CLA發(fā)酵乳的感官評價

   

   

  
  

  如圖8所示，富含共軛亞油酸的酸奶的評分良好，平均分為90.35；組織狀態(tài)、滋味、風味、色澤的平均分分別為27.4、26.95、17.75、18.25。風味的感官評分較低，原因可能是發(fā)酵核桃乳中有機酸、脂肪酸等營養(yǎng)成分含量的增減在一定程度上會改變物質(zhì)的香氣成分，與李佳^[29]的研究相似，發(fā)酵后的發(fā)酵乳會要呈現(xiàn)一定的生味和油脂。

  4 結(jié)論

  實驗室篩選的Lactobacillus fermentumL1可與Streptococcusthermophilus和Lactobacillus bulgaricus復配制作發(fā)酵乳。響應面優(yōu)化實驗得到最佳工藝，研制出一款色香味俱佳，活菌數(shù)達為lg 8.0 CFU/mL，CLA含量達225.56μg/mL的富含CLA的發(fā)酵乳。該發(fā)酵乳的研制豐富了核桃發(fā)酵乳的種類，并為富含CLA的發(fā)酵食品的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

   

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