樣品保存條件對乳成分、體細(xì)胞和尿素氮的影響
劉琴1成玉梅2周亞平1張利坤2李春2施開平2
1. 昆明市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 云南昆明 650041
2. 昆明市奶牛生產(chǎn)性能測定中心 云南昆明 650041
摘要：將6個(gè)添加了防腐劑的牛奶分成兩份，一份保存于常溫，一份保存于4℃，常溫條件下樣品連續(xù)測定7天，冷藏條件下樣品連續(xù)測定8天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)冷藏條件下牛奶較穩(wěn)定，脂肪、蛋白、乳糖指標(biāo)在常溫保存條件下，最好在四天之內(nèi)測定完畢，冷藏條件下可保存至少一周；體細(xì)胞在常溫保存條件下樣品最好在3天之內(nèi)檢測完畢，超過3天后體細(xì)胞下降達(dá)到10萬以上，冷藏條件下可以保存至少一周；測定尿素氮，由于尿素氮指標(biāo)不穩(wěn)定，不論是常溫或是冷藏最好不要超過三天。
關(guān)鍵詞：樣品保存， DHI，乳成分、體細(xì)胞、尿素氮、影響
近年來，我國奶牛生產(chǎn)性能（DHI）測定工作不斷得到深入，參測牛只數(shù)量每年呈上升的趨勢，一方面是國家對該項(xiàng)工作的重視，不斷加大投入；另一方面是奶牛場（奶農(nóng)）對DHI測定工作重要性認(rèn)識不斷加強(qiáng)，自覺參加測定。DHI測定工作的意義不僅體現(xiàn)在全國層面上的種公牛選育，對于牛場來說更是為奶牛飼養(yǎng)管理提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，因此其數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性意義重大。昆明市自2009年開始DHI測定工作以來，已累計(jì)參測奶牛3萬余頭，成效比較顯著。但是由于牛場分布較廣，送樣時(shí)間較長，為探討牛奶保存時(shí)間對DHI測定結(jié)果的影響，為DHI采樣工作提供依據(jù)，昆明市動物衛(wèi)生監(jiān)督所及昆明市奶牛奶業(yè)協(xié)會通過樣品在常溫和冷藏條件下連續(xù)測定，研究不同保存條件和時(shí)間對DHI測定結(jié)果的影響。現(xiàn)將其報(bào)道如下。
1. 儀器和材料
1.1 儀器：CombiFoss™ FT+牛奶體細(xì)胞成分聯(lián)機(jī)分析儀，水浴鍋（北京中興）。
1.2 樣品：在昆明市晉寧縣6個(gè)奶牛場共采集6份樣品，每份樣品1000ml，加入防腐劑（按每50ml加入1粒專用防腐劑，其主要成分溴硝基丙二醇）。樣品采集后分成兩份，一份存于4℃，一份存于常溫。測定前水浴至42℃。分別檢測脂肪、蛋白、乳糖、體細(xì)胞、尿素氮，連續(xù)測定7-8天。
2. 方法
2.1 儀器校準(zhǔn)：脂肪、蛋白、乳糖用奶牛全國畜牧總站DHI標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備實(shí)驗(yàn)室提供的標(biāo)準(zhǔn)品定標(biāo)，每月一次定標(biāo)。每次檢測前用清洗調(diào)零，并用校核樣檢測。體細(xì)胞用FOSS公司的FMA校核，尿素氮自校準(zhǔn)。
2.2 樣品測定：樣品42℃水浴加熱25-30min，測定脂肪、蛋白、乳糖、體細(xì)胞、尿素氮5個(gè)指標(biāo)。常溫保存測定連續(xù)7天，冷藏保存連續(xù)測定8天。
2.3 數(shù)據(jù)分析 用EXCEL 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 16.0 進(jìn)行配對T檢驗(yàn)，0.05為顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。
3. 結(jié)果
3.1 對脂肪的影響
常溫和冷藏對脂肪的影響不明顯。六個(gè)樣品連續(xù)一周測定的值見表1、2。連續(xù)測定值與第一天測定結(jié)果的T值見表3。從表3可以看出，兩種保存條件連續(xù)一周測定結(jié)果與第一天的T值均大于0.05，差異不顯著。常溫條件下，脂肪的變化幅度較大，6個(gè)樣品的連續(xù)測定，與第一天的差值平均值從0.06至-0.03，而冷藏條件下，連續(xù)測定8天，與第一天的差值都在0.02，差異很小。
3.2 對蛋白的影響
保存方式對蛋白的影響見表4、5，T值見表6，常溫保存條件下，T值均大于0.5，但檢測值絕對差較大，如第1號樣品在第七天差值達(dá)到0.09，第4號樣品在第六天差值較大的達(dá)到0.23。而在冷藏條件下，第四天、第六天的結(jié)果與第一天有顯著差異，T值分別為0.025和0.01，而其他日期的T值均大于0.5，但絕對差值較小，均在0.03以內(nèi)。常溫保存條件下，在第四天之內(nèi)6個(gè)樣品平均變化均在0.03以內(nèi)，而在第五天之后，樣品平均變化超過了0.04。
表4 常溫保存溫度對蛋白的影響 單位：%
|
樣品 |
第一天 |
第二天 |
第三天 |
第四天 |
第五天 |
第六天 |
第七天 |
|
1 |
2.99 |
2.98 |
2.98 |
3 |
3.04 |
3.01 |
3.08 |
|
2 |
3 |
3 |
2.97 |
2.99 |
3.05 |
2.98 |
2.99 |
|
3 |
3.14 |
3.13 |
3.12 |
3.13 |
3.16 |
3.07 |
3.11 |
|
4 |
2.76 |
2.81 |
2.86 |
2.92 |
2.97 |
2.99 |
未測 |
|
5 |
3.05 |
3.07 |
3.07 |
3.09 |
3.09 |
3.11 |
3.05 |
|
6 |
3.23 |
3.21 |
3.23 |
3.24 |
3.23 |
3.25 |
3.2 |
|
絕對差均值 |
|
0.01 |
0.01 |
0.03 |
0.06 |
0.04 |
0.06 |
表5 冷藏對蛋白的影響 單位：%
|
樣品 |
第一天 |
第二天 |
第三天 |
第四天 |
第五天 |
第六天 |
第七天 |
第八天 |
|
1 |
2.99 |
2.98 |
2.98 |
3.02 |
3 |
3.03 |
2.98 |
2.98 |
|
2 |
3 |
2.99 |
2.97 |
3.01 |
3 |
3.02 |
2.96 |
2.98 |
|
3 |
3.14 |
3.14 |
3.11 |
3.15 |
3.15 |
3.16 |
3.12 |
3.14 |
|
4 |
2.76 |
2.76 |
2.74 |
2.77 |
2.79 |
2.8 |
2.77 |
2.77 |
|
5 |
3.05 |
3.06 |
3.08 |
3.07 |
3.05 |
3.09 |
3.05 |
3.05 |
|
6 |
3.23 |
3.24 |
3.25 |
3.23 |
3.21 |
3.25 |
3.23 |
3.23 |
|
絕對差均值 |
|
0.00 |
-0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.03 |
-0.01 |
0.00 |
3.3 對乳糖的影響
保存方式對乳糖的影響見表7、8，T值見表9。常溫保存條件下，T值均大于0.5，差異不顯著。但從數(shù)值上來看，乳糖差異較大，乳糖有降低的趨勢。如1號樣品第一天第三天相差0.06，與第七天相差達(dá)到0.14，而第4號樣品第1天與第二天相差達(dá)到0.1，與第六天差異達(dá)到0.45，可能與樣品本身有關(guān)。在冷藏條件下，差值較小，連續(xù)測定6個(gè)樣品平均變化值都在均在0.02以內(nèi)。說明冷藏條件下，乳糖值較穩(wěn)定。
表7 常溫對乳糖的影響 單位：%
|
樣品 |
第一天 |
第二天 |
第三天 |
第四天 |
第五天 |
第六天 |
第七天 |
|
1 |
4.74 |
4.71 |
4.68 |
4.72 |
4.69 |
4.62 |
4.6 |
|
2 |
4.68 |
4.68 |
4.67 |
4.68 |
4.69 |
4.64 |
4.66 |
|
3 |
4.62 |
4.62 |
4.61 |
4.63 |
4.63 |
4.52 |
4.58 |
|
4 |
4.53 |
4.43 |
4.35 |
4.34 |
4.23 |
4.08 |
未測 |
|
5 |
4.78 |
4.81 |
4.82 |
4.83 |
4.84 |
4.79 |
4.8 |
|
6 |
4.85 |
4.81 |
4.87 |
4.87 |
4.84 |
4.83 |
4.82 |
|
絕對差均值 |
|
-0.02 |
-0.03 |
-0.02 |
-0.05 |
-0.12 |
-0.01 |
表8 冷藏對乳糖的影響 單位：%
|
樣品 |
第一天 |
第二天 |
第三天 |
第四天 |
第五天 |
第六天 |
第七天 |
第八天 |
|
1 |
4.74 |
4.74 |
4.72 |
4.78 |
4.72 |
4.72 |
4.71 |
4.75 |
|
2 |
4.68 |
4.69 |
4.63 |
4.73 |
4.67 |
4.67 |
4.64 |
4.69 |
|
3 |
4.62 |
4.63 |
4.59 |
4.64 |
4.64 |
4.6 |
4.61 |
4.64 |
|
4 |
4.53 |
4.52 |
4.47 |
4.55 |
4.56 |
4.49 |
4.53 |
4.52 |
|
5 |
4.78 |
4.8 |
4.83 |
4.84 |
4.8 |
4.79 |
4.78 |
4.83 |
|
6 |
4.85 |
4.86 |
4.87 |
4.87 |
4.83 |
4.83 |
4.86 |
4.87 |
|
絕對差均值 |
|
0.01 |
-0.01 |
0.04 |
0.00 |
-0.02 |
-0.01 |
0.02 |
3.4 對體細(xì)胞的影響
保存條件對體細(xì)胞的影響較大，結(jié)果見表10 、11，T值見表12。常溫條件下，在第三天之內(nèi)，6個(gè)樣品的體細(xì)胞變化平均值在10萬以內(nèi)，在第四天以后，6個(gè)樣品變化平均值超過10萬，在第五天后，體細(xì)胞數(shù)與第一天的結(jié)果差異極顯著（T值小于0.05），體細(xì)胞隨保存時(shí)間延長持續(xù)下降，在第七天時(shí)下降幅度接近50%，見圖1。而在冷藏條件下，體細(xì)胞相對穩(wěn)定，在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)T值均大于0.05，差異不顯著，連續(xù)測定八天絕對差值都在15萬/mL以內(nèi)，6個(gè)樣品絕對差均值在4萬以內(nèi)。
表 10 常溫對體細(xì)胞的影響 單位：萬/mL
|
樣品 |
第一天 |
第二天 |
第三天 |
第四天 |
第五天 |
第六天 |
第七天 |
|
1 |
155 |
149 |
121 |
100 |
85 |
80 |
68 |
|
2 |
145 |
133 |
115 |
109 |
96 |
86 |
80 |
|
3 |
130 |
134 |
127 |
123 |
115 |
110 |
103 |
|
4 |
62 |
68 |
63 |
65 |
61 |
54 |
未測 |
|
5 |
70 |
78 |
61 |
55 |
52 |
45 |
39 |
|
6 |
161 |
197 |
180 |
161 |
149 |
140 |
144 |
|
絕對差均值 |
|
6 |
-9 |
-18 |
-28 |
-35 |
-34 |
表 11 冷藏對體細(xì)胞的影響 單位： 萬/mL
|
樣品 |
第一天 |
第二天 |
第三天 |
第四天 |
第五天 |
第六天 |
第七天 |
第八天 |
|
1 |
155 |
170 |
158 |
148 |
153 |
156 |
137 |
140 |
|
2 |
145 |
147 |
138 |
142 |
147 |
148 |
137 |
137 |
|
3 |
130 |
150 |
137 |
143 |
146 |
141 |
143 |
139 |
|
4 |
62 |
62 |
58 |
60 |
57 |
60 |
58 |
51 |
|
5 |
70 |
68 |
69 |
69 |
74 |
71 |
68 |
71 |
|
6 |
161 |
160 |
163 |
163 |
158 |
165 |
160 |
161 |
|
絕對差均值 |
|
6 |
0 |
0 |
2 |
3 |
-3 |
-4.00 |
3.5 對尿素氮的影響
保存方式對尿素氮的影響見表13、14，T值見表15。常溫條件下，T值均大于0.05，差異不顯著，但是尿素氮值忽高忽低，差異較大（1號和5號樣品第一天和第三天差異已經(jīng)達(dá)到1.4，6號樣品第一天和第三天的差異達(dá)到2.5）。而冷藏條件下，第一天和第四天，第一天和第七天T值小于0.05，差異顯著，但規(guī)律性不強(qiáng)�？傮w上來說，不論是常溫或是冷藏，尿素氮指標(biāo)值不穩(wěn)定，采樣后要及時(shí)檢測。
表13 常溫對尿素氮的影響 單位：mg/100mL
|
樣品 |
第一天 |
第二天 |
第三天 |
第四天 |
第五天 |
第六天 |
第七天 |
|
1 |
5.7 |
5.6 |
4.3 |
7.2 |
5.3 |
1.8 |
0 |
|
2 |
8.2 |
6.9 |
9.9 |
9.3 |
9 |
9.4 |
10.1 |
|
3 |
6.8 |
6.9 |
9.4 |
8.9 |
10.5 |
11.4 |
12.9 |
|
4 |
2.6 |
0.8 |
0 |
0 |
0 |
0 |
未測 |
|
5 |
6.3 |
6.8 |
7.6 |
8.7 |
6.3 |
7.4 |
8.6 |
|
6 |
7.8 |
8.9 |
10.3 |
9.1 |
9.6 |
10.2 |
10.8 |
|
絕對差均值 |
|
-0.2 |
0.7 |
1.0 |
0.6 |
0.5 |
2.3 |
表14 冷藏對尿素氮的影響 單位：mg/100mL
|
樣品 |
第一天 |
第二天 |
第三天 |
第四天 |
第五天 |
第六天 |
第七天 |
第八天 |
|
1 |
5.7 |
5.3 |
6.9 |
7.4 |
6.1 |
6.5 |
5.9 |
8.1 |
|
2 |
8.2 |
8.5 |
7 |
8.4 |
8.1 |
7.4 |
9.1 |
10.3 |
|
3 |
6.8 |
5.9 |
7 |
7.6 |
7.1 |
6.7 |
6.9 |
9.1 |
|
4 |
2.6 |
3.6 |
3.7 |
3.6 |
2.7 |
4.4 |
3.8 |
4.3 |
|
5 |
6.3 |
6.7 |
7.4 |
6.6 |
6.5 |
7 |
6.8 |
7.9 |
|
6 |
7.8 |
8.9 |
8.3 |
7.8 |
8.5 |
8.5 |
8.2 |
9.5 |
|
絕對差均值 |
|
0.3 |
0.5 |
0.7 |
0.3 |
0.5 |
0.6 |
2.0 |
圖2 保存方式對尿素氮的影響
4. 討論
4.1 脂肪：常溫保存時(shí)，第二天脂肪結(jié)果升高，6個(gè)樣品平均差異達(dá)到0.06，然后檢測值又逐漸下降，規(guī)律性不強(qiáng)，差異不顯著，可能是樣品本身的問題。冷藏對脂肪的影響不大，保存一周之內(nèi)對檢測結(jié)果影響在0.03之內(nèi)。
4.2 蛋白：常溫保存情況下，連續(xù)測定七次，與第一天的T值都在0.05以上，常溫保存時(shí)，蛋白質(zhì)在第五天6個(gè)樣品的差異平均值達(dá)到0.06，說明保存期超過第五天以上時(shí)，差異較大。而冷藏保存條件下，第四天、第六天的結(jié)果與第一天有顯著差異，T值分別為0.025和0.01，但考慮第五天、第七、八天的差異不顯著，連續(xù)測定8天差異平均差異都在0.03以內(nèi)，說明差異可以忽略不計(jì)。
4.3 乳糖：常溫保存時(shí)，連續(xù)測定七天T值都在0.05以上，但是第五天之后6個(gè)樣品差異平均值達(dá)到0.05。而冷藏保存條件下，雖然在第三天時(shí)，差異極顯著，但隨后的幾天內(nèi)，T值均大于0.05，連續(xù)測定8天6個(gè)樣品平均差異都在0.02以內(nèi)，說明差異來自于樣品本本身。
4.4 體細(xì)胞：常溫保存時(shí)，在第二、三天，體細(xì)胞差異都在10萬以內(nèi)，在第四天后，6個(gè)樣品差異平均值都在10萬/mL以上，且在第五天后體細(xì)胞與第一天的T值都小于0.05，說明體細(xì)胞變化顯著。而冷藏條件下，連續(xù)測定8天6個(gè)樣品平均變化都在5萬以內(nèi)，說明冷藏條件下可以保存一周以上。
4.5 尿素氮：不論是常溫或冷藏，尿素氮測定值不穩(wěn)定，規(guī)律性不強(qiáng)，忽高忽低，原因尚不明確。常溫條件下，保存至第七天，尿素氮平均變化超過2.0，冷藏條件下，保存至第八天，尿素氮變化也超過2.0。
5 結(jié)論
5.1常溫保存樣品穩(wěn)定性不如冷藏條件，因此樣品采集后盡量冷藏保存。檢測脂肪、蛋白、乳糖時(shí)，如果常溫保存，最好在第四天之內(nèi)測定，如果需要長途運(yùn)輸要有冷鏈措施。冷藏條件下至少可以保存8天以上。
5.2 測定體細(xì)胞時(shí)，常溫對體細(xì)胞的影響比較大，隨時(shí)間延長，體細(xì)胞數(shù)下降，冷藏條件下也如此，但下降幅度較小。檢測體細(xì)胞時(shí)，常溫保存樣品要在3天之內(nèi)檢測，冷藏條件下可以保存至少一周。
5.3 測定尿素氮時(shí)，由于其很不穩(wěn)定，樣品采集以后最好能在第二天內(nèi)測定完畢。超過3天，尿素氮指標(biāo)變化可能會較大，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。