水牛繁殖新技術(shù)研究進(jìn)展
                                                                  楊紅遠(yuǎn)  洪瓊花
                                         （云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，云南  昆明  650224）
　　
　　水牛作為一種重要的家畜，過去主要用于役使，隨著社會的發(fā)展水牛作為畜力的價值越來越低。但是，水牛在惡劣生活環(huán)境下的高產(chǎn)肉率、高瘦肉率、高產(chǎn)奶量下的高乳脂肪率，在高熱環(huán)境下的良好生活力等特點(diǎn)引起了越來越多的關(guān)注。發(fā)揮水牛的這些優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展水牛產(chǎn)業(yè)對發(fā)展經(jīng)濟(jì)，特別是提高農(nóng)村人口的生活水平具有重要作用。然而，水牛的繁殖方面卻存在著大量的問題，與黃牛相比繁殖率更低，這主要是由于水牛性成熟晚，季節(jié)性發(fā)情和發(fā)情表現(xiàn)不明顯，受精率低等。所以，研究水牛的繁殖技術(shù)、快速提高水牛群體的數(shù)量和質(zhì)量成為目前國內(nèi)外畜牧業(yè)的一個熱點(diǎn)。
1 .胚胎移植
　　水牛的胚胎移植方法從黃牛的胚胎移植發(fā)展而來。胚胎移植在水牛繁殖上的應(yīng)用潛力是巨大的，它可以短期內(nèi)產(chǎn)生大量同質(zhì)高產(chǎn)后代，因此，在種公牛的選擇上可以用它們的同胞和半同胞成績，而不是原來那樣應(yīng)用它們的女兒成績來測定，這樣就大大縮短了世代差。這些技術(shù)的應(yīng)用可以有效地降低世代差，從6.28到3.25，加快了遺傳改良的速度。
　　自1983年Drost進(jìn)行的第一次水牛胚胎移植在美國成功產(chǎn)下犢牛至今，20多年的時間里，人們做了大量的實驗，一直在想方設(shè)法提高胚胎移植的效率。2006年，Danilda在菲律賓將河流型水牛胚胎移植到沼澤型水牛受體中也已經(jīng)產(chǎn)出了犢牛；2007年，廣西水牛研究所梁賢威等將體外生產(chǎn)河流型水牛鮮胚移植到沼澤型及沼澤型與河流型的雜交一代兩個受體群中并產(chǎn)犢。雖然至今在印度就有186頭胚胎移植產(chǎn)出的水牛，但是，與移植的胚胎數(shù)量相比，卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到黃牛的水平。由于胚胎移植是一套技術(shù)的集成，它包括供受體選擇、同期發(fā)情、超數(shù)排卵、人工授精、胚胎回收和胚胎移植，所以，任何一個步驟出現(xiàn)問題，都會影響到整套技術(shù)的效果。水牛的超排反應(yīng)能力低是一個主要的因素，雖然意大利的Presicce的研究證明初情期前的水牛在超排作用下卵巢上比成年水牛有更多的卵泡發(fā)育，但到目前為止，水牛每次超排沖出的胚胎還是在2枚左右。1999年，Misra在印度應(yīng)用Folltropin超排法，每次沖胚所取得的胚胎平均為2.8枚，胚胎移植后的受胎率僅在26.4％。另一個原因是水牛精液質(zhì)量的變異非常大，這可能由于水牛本身遺傳的問題，也可能由于其它的環(huán)境和季節(jié)因素，而且，水牛的精液在低溫保存的過程當(dāng)中其自身的抗氧化酶的活力低而更易于被氧化，所有這些都造成了水牛卵母細(xì)胞受精率低下。
　　在水牛的胚胎移植中，水牛和黃牛屬間的胚胎移植也被探索，Drost等將13枚水牛胚胎移植到同期發(fā)情的荷斯坦奶牛體內(nèi)，但移植后沒有犢牛產(chǎn)出。
      2 .體外胚胎生產(chǎn)
      2.1 卵母細(xì)胞的來源
　　在水牛超數(shù)排卵難以取得突破性進(jìn)展的情況下，體外生產(chǎn)水牛胚胎成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。體外胚胎生產(chǎn)涉及到卵母細(xì)胞采集、卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精和受精卵的體外培養(yǎng)。為了擴(kuò)大卵母細(xì)胞的來源，人們作了各種各樣的努力。來源于屠宰場的卵巢提供了一個廉價并且數(shù)量多的來源，Boni等在進(jìn)行地中海型水牛胚胎體外生產(chǎn)時從每個卵巢取得的可用卵母細(xì)胞在2.4～3.3枚。相比之下，活體采卵主要采用的OPU(ovum pick up)技術(shù)的優(yōu)勢就更加明顯，除使用OPU技術(shù)可以重復(fù)從優(yōu)良水牛卵巢上取得用于體外胚胎生產(chǎn)的卵母細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)之外，OPU技術(shù)可以使每個供體每個月比超數(shù)排卵提供更多的可移植胚胎（2∶0.6）。從卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力來看OPU技術(shù)更好。在印度， Manjunatha等應(yīng)用OPU技術(shù)從供體水牛卵巢上采集卵母細(xì)胞和從屠宰場得到的卵巢上采集卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)、受精和發(fā)育后的囊胚發(fā)育率為30.6±4.3％ 和18.5±1.8％，兩種來源的胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍后解凍成活率分別為52.8±4.2％ 和40.2±4.4％，這說明應(yīng)用OPU技術(shù)來提高水牛的繁殖率潛力是巨大的。隨后，深入的研究發(fā)現(xiàn)，可以采集腔前卵泡進(jìn)行體外培養(yǎng)來獲取卵母細(xì)胞。2007年Guptaa證明將采集的腔前卵泡在MEM液和卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)體系中或MEM液和卵巢間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中進(jìn)行體外培養(yǎng)，進(jìn)而體外受精，可以得到可移植的水牛體外生產(chǎn)胚胎，這樣就可以將卵母細(xì)胞的來源擴(kuò)大到2月齡之后的任何年齡段的母水牛。Santos等近期的實驗更證明在胎兒的卵巢上也可以采集腔前卵泡，而且在FSH存在下這些卵泡可以在體外培養(yǎng)存活。Manjunatha 等從不同階段卵泡的發(fā)育潛力來探討，通過實驗證實體外卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力與卵巢的功能形態(tài)密切相關(guān)，在存在黃體或紅體而沒有優(yōu)勢卵泡的卵巢上的卵母細(xì)胞有最大的發(fā)育潛力，有黃體或紅體又有優(yōu)勢卵泡的卵巢上的卵母細(xì)胞，只有優(yōu)勢卵泡中的卵母細(xì)胞具有最大的發(fā)育潛力。
      2.2 體外成熟
　　卵母細(xì)胞體外成熟已經(jīng)達(dá)到了相當(dāng)高的程度（70％～90％）。培養(yǎng)液成分雖然復(fù)雜但主要成分趨于一致，多為基礎(chǔ)培養(yǎng)液（主要有TCM—l99、Ham’S F—l0MEM）加激素（FSH、LH和E2）和生長因子（EGF和IGF），再加緩沖物（Hepes和NaHCO3）。但是，有實驗表明在以上培養(yǎng)液中添加10％的卵泡液，水牛卵母細(xì)胞的第一極體排放率和成熟率均有進(jìn)一步顯著提高，在顆粒細(xì)胞單層共培養(yǎng)對水牛卵母細(xì)胞的體外成熟影響上，還有不同的意見。但是，毫無疑問的是卵丘細(xì)胞的存在與否嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)量。
　　體外成熟時間也會影響到卵母細(xì)胞后續(xù)的發(fā)育潛力，目前認(rèn)為體外成熟時間應(yīng)該不少于16h。而且，水牛卵母細(xì)胞體外成熟27h或30h的囊胚發(fā)育率(19.0％ or 17.7％)明顯高于體外成熟21h或24h的囊胚發(fā)育率(12.3％ Or 13.8％)。Sharma等對卵母細(xì)胞體外成熟時間長短對玻璃化后解凍卵母細(xì)胞成活率影響的實驗，證明體外成熟時間的長短明顯影響玻璃化解凍后的成活率和解凍后卵母細(xì)胞達(dá)到M-II期的比例，從0、6、12、18和24h對比來看，成活率與體外成熟時間的長短成正比。
      2.3 體外受精
　　水牛卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精時常采用TALP液或BO液作受精液，在獲得高活力精子時常常采用Percoll梯度離心后在獲能液中上浮的辦法來篩選。目前IVF后的卵裂率為40％～50％。但是Mishra等的試驗顯示，同樣培養(yǎng)條件下，IVF的卵裂率僅能達(dá)到36.4％，孤雌激活后的卵裂率可以達(dá)到52.5％，試驗證明水牛卵母細(xì)胞在遺傳上有很好的發(fā)展?jié)摿�，目前的IVF卵裂率可能受到多方面因素的影響，還有繼續(xù)提高的余地。共培養(yǎng)時間的長短是影響體外受精率的因素中之一，卵母細(xì)胞與精子共培養(yǎng)的時間不少于8h，才能保證精子穿透卵子，但是過長的共培養(yǎng)時間又會導(dǎo)致受精卵暴露于受精過程中產(chǎn)生的氧氣中，這對受精卵是有害的，而且，延長受精時間會導(dǎo)致多精入卵的增加；Totey等發(fā)現(xiàn)2Oh的共孵化時間對水牛體外受精是最合適的。精液濃度對體外受精率的影響上，試驗證明2xl06／ml的濃度是最佳的。獲能誘導(dǎo)劑的存在與否也是影響體外受精率的因素，這些物質(zhì)有肝素、咖啡因、青霉胺和亞牛黃酸等，它們可誘導(dǎo)精子的超運(yùn)動，降低精子穿過透明帶的時間，誘導(dǎo)精子獲能和精子頭部粒蛋白，可提高受精率、卵裂率和囊胚率。
      2.4 胚胎體外培養(yǎng)
　　在胚胎的體外培養(yǎng)中，囊胚率低始終是體外胚胎生產(chǎn)的一個制約因素。在提高囊胚率的努力中，研究發(fā)現(xiàn)輸卵管上皮細(xì)胞與受精卵共培養(yǎng)可以促進(jìn)早期胚胎的體外發(fā)育，克服發(fā)育中的阻斷現(xiàn)象，增加可以發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)量；克服發(fā)育阻斷現(xiàn)象的另一個方法是每隔48h的半量換液。引起牛胚胎發(fā)育阻滯的另一個重要原因是體外條件下產(chǎn)生多種氧化產(chǎn)物和過氧化物分子對胚胎的傷害，Gasparrini等加胱氨酸于半胱胺（巰(基)乙胺）富集的培養(yǎng)體系能夠顯著增加卵裂率和可移植胚胎的數(shù)量。然而，這些措施都沒能使體外胚胎培養(yǎng)的囊胚率超過35％。
　　總體看來，目前體外生產(chǎn)胚胎由于其高代價和低效率（產(chǎn)犢率只有10.5％）、體外生產(chǎn)胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后的存活率又非常低等原因都限制了IVF技術(shù)的大規(guī)模商業(yè)應(yīng)用，還只能處在小范圍的實驗階段。
      3. 性別控制
　　性別控制技術(shù)在家畜繁殖中的作用顯而易見，在那些經(jīng)濟(jì)效益與性別相聯(lián)系的家畜中，應(yīng)用這一技術(shù)使得其不必等到動物出生后再來剔除不希望的性別，避免了經(jīng)濟(jì)和時間的損失。一些試驗進(jìn)行了這方面的探索，Appa Rao等1999年試驗了復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）在檢驗體外生產(chǎn)水牛胚胎性別上的有效性，結(jié)果證明應(yīng)用1～2個卵裂球細(xì)胞可以準(zhǔn)確、可靠地檢驗體外生產(chǎn)胚胎的性別。2007年廣西大學(xué)的研究者證明用黃牛的SRY基因設(shè)計的引物進(jìn)行PCR同樣可以準(zhǔn)確地判別水牛胚胎的性別。而流式細(xì)胞儀的應(yīng)用使繁殖的效率更高，Lu YQ等用流式細(xì)胞儀分離水牛X和Y精子的成功率分別是94％和89％，并用分離后的精子進(jìn)行體外受精，發(fā)現(xiàn)與未進(jìn)行分離處理的精子相比，分離精子進(jìn)行受精的胚胎發(fā)育率明顯下降，但6～8天的桑椹胚發(fā)育率無顯著差異，X精子受精胚胎經(jīng)移植后產(chǎn)出2頭母犢。2005年P(guān)resicce等用經(jīng)過分離后的精子進(jìn)行人工授精后成功得到的后代，與自然受精產(chǎn)生的后代在出生重和生活力上沒有差別。
      4. 克隆技術(shù)
　　通過細(xì)胞核移植是一個潛在的提高水牛繁殖率的方法。2005年Meena CR通過將水牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中，經(jīng)電融合和激活后有3.8％的可以發(fā)展到8細(xì)胞階段。2007年Shi D等將水牛胎兒成纖維細(xì)胞和粒層細(xì)胞的細(xì)胞核移植產(chǎn)生的囊胚42枚移植到受體水牛中，產(chǎn)下5頭犢牛。證明通過細(xì)胞核移植的克隆方法在水牛的繁殖上是可行的。體細(xì)胞克隆是提高水牛數(shù)量的一個有潛力的途徑，但是，與其它物種實驗類似的是這種克隆胚胎的發(fā)育潛力也會受到損害。經(jīng)過基因重組和核移植的水牛胚胎從8細(xì)胞到囊胚的基因表達(dá)水平明顯的高于體外受精胚胎。這說明基因重組和核移植的水牛胚胎中的DNA存在低水平的被動甲基化和高水平的重新甲基化。
    毫無疑問，在過去的十多年間我們在水牛繁殖新技術(shù)的研究上取得了許多進(jìn)步也積累了大量有關(guān)水牛遺傳和生理結(jié)構(gòu)獨(dú)特性的知識。然而，正像本文所述，還有一些技術(shù)的難點(diǎn)未能突破，如何結(jié)合實際在這些問題上盡快取得進(jìn)展，加快水牛的繁殖效率，是我們面對的緊迫任務(wù)。

（參考文獻(xiàn)：共20篇略）