家畜胚胎的性別鑒定和后代性比例的控制，是現(xiàn)代畜牧科學研究和生產(chǎn)的重大課題之一，它對提高畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟效益有著十分重要的意義。
人們對不同用途(品種)的牛，有著不同的要求。由于性別不同，牛的生產(chǎn)性能和特點也不相同，性別之間的經(jīng)濟價值也相差懸殊。以牛為例，對奶牛來說，產(chǎn)奶母牛的經(jīng)濟效益較高，因此人們都希望它多產(chǎn)母犢。如能有計劃地控制雄性的出生率，就可以使產(chǎn)奶母牛數(shù)量按指數(shù)遞增，獲得最大的經(jīng)濟效益。
(一)胚胎的性別鑒別 隨著胚胎分割和胚胎冷凍技術(shù)的發(fā)展，使我們有可能用1枚半胚做性別鑒定；而另一枚半胚供冷凍后移植，這樣就大大地縮短了胚胎在體外培養(yǎng)的時間。Picand(1984)等報道，將半胚在體外培養(yǎng)的時間由24h縮短到4h，鑒定后的胚胎移植成功率由5％提高到60％。目前胚胎性別的鑒定主要是通過細胞學方法和免疫學方法2個途徑。
1．細胞學方法 是用顯微外科手術(shù)將胚胎內(nèi)的細胞取出一些，在體外培養(yǎng)來觀察X、Y染色體。10—12日齡的牛胚胎性別鑒定可靠性可達70％左右。加拿大用14日齡的牛胚胎，切取一小片滋養(yǎng)層細胞進行活組織檢查，以染色體來判定胚胎的性別，曾對32個胚胎進行測定，判定性別的22個胚胎，移植后有10個妊娠。德國判定性別的準確率更高，1978年已出生七八個小牛，結(jié)果完全準確。但是7日齡的牛胚胎進行性別鑒定卻無結(jié)果，因為這一時期的胚胎可供檢驗的染色體數(shù)目太少。我國胡明信等用動物性染色體RSP進行性別鑒定，利用動物DNA限制性內(nèi)切酶去識別特定的堿基順序，特異性地把DNA切割成一定大小的片段，并制備帶有同位素標記的特異基因探針進行分子雜交，從而達到基因的鑒定，并研究這些片斷與基因的缺乏或異常。由于基因突變而呈現(xiàn)一定的DNA限制性內(nèi)切酶切點多態(tài)性(簡稱RSP)，利用性染色體DNA酶譜進行性別的鑒定。RSP對遺傳育種水平的提高，縮短后裔測定的時間，具有重要意義。
2．免疫學方法 此法是用特異抗體來測定雄性胚胎細胞表面上的H-g抗原(一種組織相容性抗原)。它是只有雄性細胞才能產(chǎn)生的特異蛋白抗原，這種特異蛋白是由DNA翻譯在Y染色體上，而且是每個雄性細胞膜上有成千上萬個這種翻譯過來的復本，所以測定這種蛋白比觀察性染色體(DNA)更為靈敏，因為DNA只有一個復本。這種方法的特點是不需殺死胚胎，或不從胚胎取活組織就可以測定。它可借助于結(jié)合在具有熒光物質(zhì)上的無性系抗體進行觀察。我國馬向東應(yīng)用繁殖免疫學原理和方法，制備H-Y單克隆抗體進行移植前的胚胎性別鑒定已獲成功。胡明信等首次合成了牛類Sry特異引物并通過PCR直接擴增牛胚的Sry特異DNA序列對牛胚的性別鑒定與分娩結(jié)果相等，顯示了控制性別不久即將成為現(xiàn)實。
(二)后代性別比例的控制 近代對性別決定因子的研究認為，哺乳動物含Y染色體的精子與卵子受精，形成XY型合子，發(fā)育成為雄性個體。含X染色體的精子與卵子受精形成XX合子發(fā)育成為雌性個體。根據(jù)這一基本原理，人們在控制后代性別比例方面，進行了一系列研究。大致可分為：①處理精液，分離X、Y精子；②控制環(huán)境因素使其適合所需要的精子，有利于受精。分述如下：
1．處理精液，分離X、Y精子
(1)X與Y精子的差異 根據(jù)近代研究證明，X與Y精子在許多方面存在著一定差異。如X精子比Y精子頭部大而圓，體及核也較大，Y精子頭部小而尖；X與Y精子的DNA有含量差異，在牛方面差異為3％～9％；精子膜的分布也有差異，Y精子尾部膜電荷量較高，X精子頭部膜電荷量較高；Y精子帶有H-Y抗原，X精子則無；Y精子對H-Y抗原的抗力有反應(yīng)，X精子則無。Caperosn(1968)利用Q-M法，發(fā)現(xiàn)染色體長臂末端的強熒光點，這些亮點稱為F—小體(熒光小體)。用這種方法可以分離精子，也可用以鑒定其他方法分離的精子。但經(jīng)過此方法(Q—M法)處理的精子已被破壞而無受精能力。
X與Y精子的運動能力也不相同，Y精子運動能力較強，在含血清蛋白的稀釋液中呈直線前進運動。另外也有報道，Y精子較耐弱堿而不耐酸性，X精子則較耐弱酸性而不耐堿性等�；谝陨锨闆r，人們進行了大量分離X、Y精子的研究。
(2)離心法 有人根據(jù)精子大小、比重不同的差別，利用含卵黃一檸檬酸鈉液的梯度離心柱將兔子精液分為上下兩層，上層精液得雄兔65％，下層精液得母兔65％。
(3)沉降法 利用一定密度、黏度、pH、滲透壓并有營養(yǎng)的液體對牛精液沉降分離，沉降最快的部分授精后，雌性比例明顯增加(53．9％：46．8％)，但任何部分都未增加雄性比例。Bhattasharga等(1977)對牛精液進行沉降處理后，再用強力——對流法將精液純化，在層柱上層部分獲81．1％雄性，底層部分獲91．9％雌性。一般認為以上兩種方法只能使某一性比例提高70％～75％。
(4)過濾法 利用X、Y精子大小不同的特點，用G-50葡聚糖凝膠柱或過濾器進行過濾，這種方法在兔子方面取得較好效果，在牛未見報道。
(5)熒光色素標記法 利用熒光色素標記Y精子的熒光小體，利用光電儀設(shè)備將X、Y精子分離。據(jù)報道分離率可達80．4％。但具體用于授精及后代性比則未見報道。
(6)電泳法 利用X、Y精子所帶生物電的不同，采用電泳法對精子分離，分別收集陽極、陰極移動精子。授精后陽極精子后代雌性占71．3％，陰極雄性占63．8％。
除以上方法外，尚有免疫法、流式細胞光度法等。但總結(jié)以上精子的各種分離方法，均尚未達到實用階段。在有些方法及理論上也有爭議。目前國內(nèi)外的研究正在繼續(xù)開展，期待有較大突破。
2．利用配種授精環(huán)境條件控制后代性別比例
(1)精氨酸法 日本黑木常春1978年以生理鹽水稀釋精氨酸分為高、中、低濃度，輸精前20～30min向陰道輸入某一濃度溶液1～2ml，結(jié)果高、低濃度產(chǎn)雄性多，中等濃度的產(chǎn)雌性多。我國內(nèi)蒙古翁牛特旗詹水林根據(jù)日本黑木常春用精氨酸法控制日本黑色和牛性比的報道，1982年冷配黃牛11頭，獲得9頭母犢，占81．8％。但試驗數(shù)據(jù)較小，說服力不強。河南省虞城縣畜牧局陳壽南(1987—1988)在農(nóng)村用精氨酸法先后共配母黃牛145頭，共生母犢86頭，占71．66％，同供試母牛前胎相比，受胎率基本一致(82．76％：82．06％)，而公母比例分別為28．34％(公)：71．66％(母)和59％(公)：60％(母)，差異極顯著(P<0．01)。其具體做法是：選年齡3～5歲，經(jīng)產(chǎn)1—2胎、無產(chǎn)科病史、健康、發(fā)情lOh以上的母黃牛，用北京化工廠生產(chǎn)的人用25％精氨酸20ml，加入80ml醫(yī)用生理鹽水，配成5％的濃度，給每頭待配母牛作子宮頸深部輸入2ml，停20～30min后輸入解凍的足量凍精，必要時在一個情期再復配一次。
寧夏中衛(wèi)縣畜牧站張巨順在日本黑木試驗的啟示下，1986年開始在中衛(wèi)縣良種繁殖場和柔遠配種站分別對奶牛和黃牛進行了類似的試驗。試驗分兩個階段：1986年配種至1987年產(chǎn)犢為第一階段，1987—1988年產(chǎn)犢為重復試驗階段。供試牛奶牛來自良種繁殖場奶牛隊無生殖道疾患的適齡母牛，隨機分為3組。第1組和第2組每組15頭，分別用濃度為5％和10％的精氨酸處理(精氨酸系武漢大學九·一二生化微生物工廠生產(chǎn)的人用針劑，每安瓿20ml，內(nèi)含精氨酸25％。試驗前用生理鹽水稀釋成5％和10％2種濃度，再用滅菌的2ml安瓿分裝，每安瓿裝入lml)。第1、2組母牛于發(fā)情配種前在子宮頸內(nèi)3cm處分別將5％和10％濃度的精氨酸輸入lml，然后間隔20～30min輸入冷凍精液。柔遠點的供試牛黃牛群也采取同一方法進行處理。第3組20頭作對照，不作精氨酸處理。
試驗群中，奶牛全部為舍飼，試驗前、后期用同一飼料配方。黃牛舍飼加放牧。兩個點的供試牛均為中等膘情，并用同一奶�；蛭鏖T塔爾公牛的凍精進行人工授精配種。
試驗結(jié)果表明：
�、倌膛ｊ犜囼炄�1986—1988年兩期試驗中試驗組共產(chǎn)犢56頭，其中母犢41頭，占73．2％；對照組共產(chǎn)犢34頭，其中母犢14頭，占41．2％。試驗前(1981—1986)6年內(nèi)平均產(chǎn)母犢38．01％，試驗組較同期對照組產(chǎn)母犢比例高32％，較試驗前6年間平均值高35．1％。
�、谌徇h點黃牛試驗群1986—1988年兩期試驗中試驗組共產(chǎn)犢47頭，其中母犢33頭，占70．2％；對照組共產(chǎn)犢31頭，其中母犢15頭，占48．4％，試驗組較對照組產(chǎn)母犢比例高21．8％。
�、蹆煞N濃度的比較。從2年試驗結(jié)果看，奶牛隊5％的濃度組共產(chǎn)犢26頭，其中母犢17頭，占65．4％；10％的濃度組共產(chǎn)犢30頭，其中母犢24頭，占80．0％；10％濃度組比5％組的母犢率高14．5％。柔遠點5％濃度組共產(chǎn)犢25頭，其中母犢18頭，占72．0％；10％濃度組比5％濃度組產(chǎn)母犢比例高0．7％。
由以上試驗結(jié)果看出，使用精氨酸對提高奶牛和黃牛的母犢比例均有明顯效果。其中奶牛使用效果又優(yōu)于黃牛。奶牛用10％的精氨酸比5％的效果好，而用于黃牛則兩種濃度差異不顯著，其中原因有待進一步分析。
精氨酸法具有取材容易，方法簡單，操作方便，成本低廉，效果穩(wěn)定等優(yōu)點，便于在基層大面積推廣。
(2)pH與性別比例的關(guān)系 如上所述，決定雄性的基因位于Y染色體上。含有Y染色體的精子耐酸性差，在微酸環(huán)境中精子活率很快下降；含有X染色體的精子，其耐酸能力相對較強。當解凍液的pH低于6．8時，含有Y染色體的精子活力減弱，運動緩慢，在它還未到達受精部位、并經(jīng)獲能后具有受精能力時，卵子可能已與含有X染色體的精子結(jié)合，故母牛懷胎后就多產(chǎn)母犢。如果解凍液pH高于7時，則含有Y染色體的精子活力增強，運動迅速，能較快地到達受精部位，與卵子結(jié)合的機會增多，所以母牛懷孕后多產(chǎn)公犢。據(jù)姜西安等(1988)試驗，解凍液pH為6．4時，產(chǎn)母犢比例最高，達到71．0％，其次是pH為7．1和6．5，分別為62％和60％，再次是pH為6.3和6.6，產(chǎn)母犢比例均為55％，最差的是pH6.2，產(chǎn)母犢比率為47％。說明含有X染色體的精子，其耐酸能力較含有Y染色體的要強。
另據(jù)李方來(1984)對溫嶺高峰牛母牛陰道黏液pH與受胎率及產(chǎn)犢性別關(guān)系的試驗，經(jīng)測定306頭高峰母牛一次配種289頭受胎，受胎率達98．4％(96．1％～100％)。pH≤6．8時，受胎率50％，pH≤7．6時，受胎率為76．7％。作者調(diào)查了258頭母牛的產(chǎn)犢性別，其產(chǎn)犢224頭，其中公犢114頭，性比例為50．89％；同時發(fā)現(xiàn)配種時陰道pH愈高，母牛懷胎后產(chǎn)犢的雄性比例亦越高。當pH≤7．6時，其雄性比例為66．7％；pH≤6．8時，雄性比例為37．5％，即所產(chǎn)犢牛雌性多于雄性。pH為7．8時，所產(chǎn)犢牛性別比例雄性多于雌性。這一試驗結(jié)果與上述姜西安試驗的結(jié)論基本一致。