李永強(qiáng)^a，楊士花^b，夏曉輝^a，李淳^a，初雅潔^a，黃艾祥^a

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.食品科技學(xué)院；b.外語(yǔ)學(xué)院， 昆明 650201) 

 

摘  要：以水牛奶為材料，利用native-PAGE和SDS-PAGE，通過(guò)不同溫度和加熱條件下總?cè)榍宓鞍缀蛦误w蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，研究水牛奶乳清蛋白的熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明：水牛奶乳清蛋白在native-PAGE條件下只有b-LG一條條帶，在SDS-PAGE條件下得到4條單體乳清蛋白條帶；隨著提取溫度和時(shí)間的增加，水牛奶單體乳清蛋白和總?cè)榍宓鞍踪|(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明水牛奶乳清蛋白熱穩(wěn)定性較差；4種乳清單體蛋白中，a-LA的熱穩(wěn)定性最好，IG的熱穩(wěn)定性最差，熱穩(wěn)定性順序?yàn)椋篴-LA>b-LG>BSA>IG。

關(guān)鍵詞：水牛奶；乳清蛋白；熱穩(wěn)定性；電泳

LI Yong-qiang^a, YANG Shi-hua^b, XIA Xiao-hui^a, LI Chun^a, CHU Ya-jie^a, HUANG Ai-xiang^a

(Yunnan Agricultural University  a.College of Food Science and Technology；

b. College of Foreign Languages, Kunming 650201, China)   

 

Abstract: The heat stability of buffalo milk whey proteins were investigated by means of the changes of total whey proteins and individual whey protein at different heat temperatures and times, using native-PAGE and SDS-PAGE. Results showed only b-LG was found by native-PAGE, but four whey protein bands were found by SDS-PAGE. Individual whey protein and total whey proteins contents were decreased when temperatures and times were increased, indicated buffalo whey proteins had poor heat stability. Among the four individual whey protein, a-LA exhibited the strongest heat-tolerance but IG was opposite. The heat stability order was: a-LA >b-LG >BSA>IG.

Key words：buffalo milk；whey protein；heat stability；electrophoresis

中圖分類(lèi)號(hào)：TS252            文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A             文章編號(hào)：        

水牛奶被譽(yù)為“奶中之王”、“乳中珍品”，營(yíng)養(yǎng)全面。按總的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)折算成標(biāo)準(zhǔn)奶，1kg水牛奶相當(dāng)于荷斯坦牛奶1.85kg ^[1]。目前，云南省現(xiàn)有的水牛奶加工產(chǎn)品由于保質(zhì)期較短，很難進(jìn)入外地市場(chǎng)。超高溫瞬時(shí)滅菌（UHT）奶具有保質(zhì)期長(zhǎng)，無(wú)需冷藏保存等優(yōu)點(diǎn)，但是在加工過(guò)程中，水牛奶蛋白質(zhì)由于熱穩(wěn)定性較差，容易發(fā)生膠凝作用，影響了水牛超高溫瞬時(shí)滅菌奶的加工，制約了水牛奶產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展^[2-4]。

水牛奶加熱過(guò)程中乳清蛋白的變性被認(rèn)為蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性較差的主要原因。乳清蛋白主要包括β-乳球蛋白（b-lactoglobulin，b-LG）、a-乳白蛋白（a-lactalbumin，a-LA）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）和免疫球蛋白（immunoglobulin，IG）^[5-14]。關(guān)于水牛奶乳清蛋白的熱穩(wěn)定性研究鮮有報(bào)道，本研究利用非變性native-PAGE電泳和變性SDS-PAGE電泳，研究加熱過(guò)程中溫度和時(shí)間對(duì)水牛奶乳清蛋白穩(wěn)定性的影響，旨在為水牛奶超高溫瞬時(shí)滅菌（UHT）加工過(guò)程中解決蛋白質(zhì)熱變性提供理論基礎(chǔ)，提高水牛奶產(chǎn)品

的保質(zhì)期和銷(xiāo)售半徑，促進(jìn)云南省水牛奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

 

水牛奶，4℃冰箱中冷藏備用；b-LG，a-LA，BSA和IG標(biāo)準(zhǔn)品，TEMED；丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，Tris–HCl，SDS，β-巰基乙醇，考馬斯亮藍(lán)R250；甘油，過(guò)硫酸銨，甲醇，冰乙酸，鹽酸，氫氧化鈉等均為分析純。

DYY-6C型電泳儀，DYCZ-24A型電泳槽，WD- 9413A型凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.3.1  乳清蛋白制備

水牛奶在4℃于8500g離心15min，得到脫脂水牛奶，取樣品20mL，在50mL具塞試管中于將60，70，80，90℃中分別加熱5，10，15，20，25，30 min；然后在冰浴中迅速冷卻，用6%冰乙酸調(diào)節(jié)水牛奶pH值為4.6，在4℃于10000g離心15min，過(guò)濾得到上清，即為乳清蛋白。

1.3.2  非變性native-PAGE電泳^[15]

非變性native-PAGE電泳凝膠包括10%分離膠和4%濃縮膠。乳清蛋白和3倍體積的非變性緩沖溶液（濃度為0.1mol/L的Tris–HCl，pH值為6.8；體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%溴酚藍(lán)）混合后，用移液器取8μL樣品點(diǎn)樣進(jìn)行電泳，用質(zhì)量濃度為1g/L的R250考馬斯亮藍(lán)染色，體積分?jǐn)?shù)為7.5%的甲醇 和體積分?jǐn)?shù)為 7.5% 冰乙酸脫色。標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)標(biāo)樣b-LG，a-LA，BSA和IG同時(shí)電泳。

1.3.3  變性SDS-PAGE電泳^[15]

變性SDS-PAGE電泳凝膠包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%分離膠和4%濃縮膠。蛋白質(zhì)樣品和3倍體積的變性緩沖溶液（濃度為0.1mol/L的Tris–HCl，pH值為6.8；體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油，體積分?jǐn)?shù)為2%的SDS，體積分?jǐn)?shù)為5%的β-巰基乙醇， 0.01%溴酚藍(lán)）混合后，沸水浴中加熱5min，4℃于10000g離心15min，吸取上清8~10μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳。標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)標(biāo)樣b-LG、a-LA、BSA和IG同時(shí)電泳。

1.3.4  染色

染色液：0.1g考馬斯亮藍(lán)（R-250），50 mL乙醇, 10 mL冰乙酸，加水定容至100mL。

取出凝膠，去掉濃縮膠，作好標(biāo)記，倒入染色液搖床染色過(guò)夜。

1.3.5  脫色

脫色液：100 mL甲醇, 100 mL冰乙酸,和800 mL水。

用脫色液脫色1~2d。

1.3.6  凝膠成像

利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行蛋白的定性定量。

    乳清蛋白非變性native-PAGE電泳結(jié)果如圖1所示。圖2為溫度和時(shí)間對(duì)β-乳球蛋白質(zhì)量濃度的影響。

     圖1中，1為對(duì)照；2為60℃，5min；3為60℃，10min；4為60℃，15min；5為60℃，20min；6為60℃，25min；7為60℃，30min；8為70℃，5min；9為70℃，10min；10為70℃，15min；11為70℃，15min；12為70℃，20min；13為70℃，25min；14為70℃，30min；15為80℃，5min；16為80℃，10min；17為80℃，15min；18為80℃，20min；19為80℃，25min；20為80℃，30min；21為90℃，5min；22為90℃，10min。下同。

 由圖1可以看出，在native-PAGE電泳中，只得到了b-乳球蛋白一條帶，可能由于在非變性條件下，水牛奶中其他三種乳清蛋白穩(wěn)定性較差，b-乳球蛋白穩(wěn)定性相對(duì)較好，電泳時(shí)樣品中只有b-乳球蛋白。故只對(duì)b-乳球蛋白進(jìn)行分析。

    由圖1和圖2可以看出，在60℃下，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)β-乳球蛋白的質(zhì)量濃度從112.16 g•L^-1降到89.55 g•L^-1，變化并不明顯，說(shuō)明β-乳球蛋白在溫度較低時(shí)比較穩(wěn)定；隨著溫度的增加和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，b-乳球蛋白質(zhì)量濃度呈明顯的下降趨勢(shì)；在90℃下加熱10min后，b-乳球蛋白條帶完全消失，說(shuō)明高溫下b-乳球蛋白不穩(wěn)定，且隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，穩(wěn)定性下降。

    乳清蛋白SDS-PAGE電泳如圖3所示。圖4為溫度和時(shí)間對(duì)乳清蛋白總量的影響。

   

 

     圖3中，1~22同上。23為90℃，15min；24為90℃，20min；25為90℃，25min；26為90℃，30min；27為90℃，30min。

    由圖5可以看出，隨著提取溫度和時(shí)間的增加，水牛奶單體乳清蛋白質(zhì)量濃度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且均小于空白對(duì)照的質(zhì)量濃度3.20，2.86，126.23，15.74 g•L^-1，說(shuō)明溫度對(duì)水牛奶各單體乳清蛋白都有影響。

對(duì)于IG，溫度為80℃和90℃下均沒(méi)有條帶，70℃下加熱20min后也沒(méi)有條帶，說(shuō)明蛋白已經(jīng)完全分解，說(shuō)明IG對(duì)溫度和加熱時(shí)間十分敏感；對(duì)于BSA，90℃下均沒(méi)有條帶，80℃下加熱5min后也沒(méi)有條帶，說(shuō)明BSA對(duì)溫度和加熱時(shí)間也比較敏感；對(duì)于b-LG，90℃下加熱10min后條帶消失；a-LA在各種溫度下均有條帶。說(shuō)明4種乳清單體蛋白中，a-LA的熱穩(wěn)定性最好，IG的熱穩(wěn)定性最差，熱穩(wěn)定性順序?yàn)椋篴-LA >b-LG >BSA>IG。

  （1）水牛奶乳清蛋白在native-PAGE條件下只有b-LG一條條帶，在SDS-PAGE條件下得到4條單體乳清蛋白條帶，說(shuō)明SDS-PAGE較適合研究水牛奶乳清蛋白。

  （2）隨著提取溫度和時(shí)間的增加，水牛奶單體乳清蛋白和總?cè)榍宓鞍踪|(zhì)量濃度均呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明水牛奶乳清蛋白熱穩(wěn)定性較差。

  （3）4種乳清單體蛋白中，a-LA的熱穩(wěn)定性最好，IG的熱穩(wěn)定性最差，熱穩(wěn)定性順序?yàn)椋篴-LA >b-LG >BSA>IG。

 

[1]    王雷, 丁春華, 欒爽艷. 我國(guó)水牛奶業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀與開(kāi)發(fā)前景[J]. 中國(guó)奶牛, 2008（4）: 8-11.

[2]    袁躍云，李大林. 云南省奶水牛業(yè)2008～201 2年發(fā)展規(guī)劃和2020年遠(yuǎn)景目標(biāo)規(guī)劃研究[J]. 云南畜牧獸醫(yī)，2008增刊（2）：10-18.

[3]    李大林，袁躍云. 云南省奶水牛業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略若干問(wèn)題的思考[J]. 云南畜牧獸醫(yī)，2008增刊（2）：19-21.

[4]    黃艾祥，朱志雄. 云南水牛奶加工業(yè)發(fā)展初探[J]. 云南畜牧獸醫(yī)，2008增刊（2）：54-56.

 

[5]    RAYNAL-LJUTOVAC K, PARK Y W, GAUCHERON F, et al. Heat Stability and Enzymatic Modifications of Goat and Sheep milk[J]. Small Ruminant Research, 2007, 68: 207–220.

[6]    MIRALLES B, BARTOLOME B, RAMOS M, AMIGO L. Determination of Whey Protein to Total Protein Ratio in UHT Milk Using Fourth Derivative Spectroscopy[J]. International Dairy Journal，2000, 10: 191-197.

[7]    SHAILESH G A, RAJESH K B, ANIRUDDHA B P. Effect of Agitation on Heat-Induced Deproteination Process of Buffalo Milk Whey[J]. Journal of Food Engineering, 2008, 87: 398–404.

[8]    BRISSONA G, BRITTENB M, POULIOT Y. Heat-Induced Aggregation of Bovine Lactoferrin at Neutral pH: Effect of Iron Saturation [J]. International Dairy Journal, 2007, 17: 617-624.

[9]    NAYAK S K, MAKRARIYA A, SINGH R R B, PATEL A A, SINDHU J S, PATIL G R, TOMAR P. Heat Stability and Flow Behaviour of Buffalo Milk Added with Corn Starch [J]. Food Hydrocolloids, 2004, 18: 379–386.

[10] NAYAK S K, ARORA S, SINDHU J S, SANGWAN R B. Effect of Chemical Phosphorylation on Solubility of Buffalo Milk Proteins[J]. International Dairy Journal, 2006, 16: 268–273.

[11] ELAGAMY E I. Effect of Heat Treatment on Camel Milk Proteins with Respect to Antimicrobial Factors: a Comparison with Cows’ and Buffalo Milk Proteins[J]. Food Chemistry, 2000, 68: 227–232.

[12] SINGH G, ARORA S, SHARMA G S, SINDHU J S, KANSAL V K, SANGWAN R B. Heat Stability and Calcium Bioavailability of Calcium-Fortified Milk[J]. LWT, 2007, 40: 625–631.

[13] ON-NOM, N, GRANDISON A S, LEWIS M J. Measurement of Ionic Calcium, pH, and Soluble Divalent Cations in Milk at High Temperature[J]. J. Dairy Sci., 2010, 93(2): 515-523.

[14] ALOMIRAH H F, ALLI I. Separation and Characterization of b-Lactoglobulin and a-Lactalbumin from Whey and Whey Protein Preparations[J]. International Dairy Journal, 2004, 14: 411–419.

[15] LIN S J, SUN J, CAO D D, CAO J K, JIANG W B. Distinction of Different Heat-Treated Bovine Milks by Native-PAGE Fingerprinting of Their Whey Proteins [J]. Food Chemistry, 2010, 121: 803–808.

 

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基金項(xiàng)目：云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2010Y342)，云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目—乳品加工與質(zhì)量安全研究

作者簡(jiǎn)介：李永強(qiáng)(1975—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：liyongqiang7512@163.com    13987611915

*通訊作者：黃艾祥，博士，教授。