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嗜冷菌對牛乳的危害及檢測控制

韓中惠¹，黃艾祥¹，毛華明²，范江平¹^，^*

1．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 云南昆明 650201，

2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 云南昆明 650201

     摘要：嗜冷菌及其代謝產(chǎn)生的酶是引起原料乳及乳產(chǎn)品發(fā)生酸包、乳清分離等腐敗變質(zhì)的主要原因之一。本文綜述了嗜冷菌的分類，分析了牛乳中嗜冷菌的來源與危害，并介紹了嗜冷菌的檢測方法及對嗜冷菌的控制措施。

     關(guān)鍵詞：嗜冷菌；來源；危害；檢測方法；控制措施

     近幾年來，我國的奶類總產(chǎn)量增長迅速，2011年奶類總產(chǎn)量達(dá)3825萬噸。據(jù)預(yù)計，未來5年原料奶產(chǎn)量仍將以高速穩(wěn)步增長。原料奶營養(yǎng)豐富，是微生物的良好培養(yǎng)基，屬高危險性食品原料。嚴(yán)重污染的原料奶，蛋白質(zhì)和脂肪會被微生物產(chǎn)生的酶所氧化或水解，奶膠體系統(tǒng)喪失原有的穩(wěn)定性，并產(chǎn)生風(fēng)味缺陷。這樣的奶已無法經(jīng)受某些加工處理，生產(chǎn)的產(chǎn)品也不再具有乳香味，整體質(zhì)量受到破壞。如果奶中微生物種類多、數(shù)量高，直接影響殺菌效果，使奶制品的保質(zhì)期縮短，易引起其腐敗變質(zhì)，傳播疾病，危害人體健康。

原料奶中嗜冷菌對不同的乳制品都會造成不利的影響，國外早在20世紀(jì)80年代，在乳品生產(chǎn)過程中已經(jīng)建立了完善的嗜冷菌檢測體系。我國在乳品生產(chǎn)過程中，對嗜冷菌的控制還沒有引起足夠的重視，國家檢測標(biāo)準(zhǔn)中也尚未有明確的規(guī)定。近年來由食品衛(wèi)生問題而導(dǎo)致的多起消費事故，導(dǎo)致人們對食品的安全性提出了更高的要求。因此，加強對嗜冷菌的檢測和控制，有助于提高乳及乳制品的質(zhì)量，保證消費者的食用安全性。

1.嗜冷菌的定義和分類

1.1嗜冷菌的定義

     1887年Forster首次發(fā)現(xiàn)在0℃時，魚中仍具有在生長能力的微生物^[1]。1902年Schmidt-Nielsen首次對該類微生物做了定義：能夠在0℃生長繁殖的微生物稱之為嗜冷菌^[2]。在微生物學(xué)術(shù)界對嗜冷菌的定義有很多種。目前在乳制品行業(yè)中，國際乳品聯(lián)合會（IDF）對嗜冷菌的定義是公認(rèn)的。國際乳品聯(lián)合會（IDF）定義嗜冷菌為：能夠在7℃及以下能生長繁殖的微生物為低溫菌；在20℃及以下能生長繁殖，在10℃-15℃為最適生長溫度的微生物稱為嗜冷菌。由于嗜冷菌長期生活在低溫條件下，自身形成了一系列適應(yīng)低溫機制，這一機制主要表現(xiàn)在細(xì)胞生物膜、細(xì)胞內(nèi)的酶、冷休克蛋白、基因調(diào)控等^[3]。

1.2嗜冷菌的分類

     嗜冷菌在自然界的分布范圍極其廣泛。在高山上、極地地區(qū)，以及大洋深處嗜冷菌都可以存在；與此同時，人工制冷設(shè)備冰箱、冷庫中也大量存在嗜冷菌。很多人將嗜冷菌分為2類，1986年Hucker將嗜冷菌進(jìn)行細(xì)分，定義那些只能生活在低溫下且最高生長溫度不超過20℃，最適生長溫度等于或小于15℃，在0℃及以下都可以繁殖生長的嗜冷菌為專性嗜冷菌(Psychrophile);將最高生長溫度可以超過20℃，在0-5℃的環(huán)境中可以生長，一般生長溫度范圍在0-35℃的嗜冷菌定義為兼性嗜冷菌(Psychrotroph)^[4]。

經(jīng)過研究人員的分離鑒定，目前乳中嗜冷菌的主要種屬有：假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、黃桿菌屬(Flarobacterium)、色桿菌屬(Hromobacterium)腸道桿菌屬(Enterbacteriaceae)、微球菌屬(Micricoccus)、鏈球菌屬(Streptococus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等，其中假單胞桿菌屬(Pseudomonas)中的熒光假單胞菌(P. fluorescens)最為常見^[5]。

2.牛乳中嗜冷菌的來源與危害

2.1牛乳中嗜冷菌的來源

     嗜冷菌最主要來源于原料乳中。經(jīng)過巴氏殺菌或者超高溫殺菌等殺菌方式后，牛乳中的嗜冷菌含量極少，無菌包裝后的牛乳很難再受到外界環(huán)境的污染。因此嗜冷菌最主要存在于原料乳中，也就是說牛乳受到嗜冷菌污染的階段在加工前。加工前的牛乳受到嗜冷菌污染來源主要有以下幾個方面。

2.1.1自然環(huán)境

     嗜冷菌在自然界中廣泛存在，在采集牛乳時易受到空氣和水中的嗜冷菌污染。如果是手工擠奶，在擠奶的過程中牛乳與空氣接觸的機會很大，空氣中的嗜冷菌很有可能落入牛乳中；牧區(qū)的條件有限，使用的水多是井水，井水中的嗜冷菌比自來水的多，牛乳受到井水污染的程度加大。

2.1.2擠奶及儲運設(shè)備

     在擠奶器襯內(nèi)表面和冷卻罐中含有嗜冷菌的數(shù)量較多^[6]，特別是設(shè)備停車期間，如果設(shè)備清洗不徹底，嗜冷菌會大量的繁殖，而造成對原料奶二次污染。

2.1.3奶牛的乳房和乳頭表面

     蘇景輝等人對管理一般和管理較好的牧場中的奶牛乳房和乳頭表面進(jìn)行檢測都發(fā)現(xiàn)有嗜冷菌的存在^[6]。

2.2嗜冷菌對牛乳的危害

     嗜冷菌本身對牛乳的危害不是很大，因為經(jīng)過殺菌后，牛乳中的嗜冷菌幾乎完全殺滅。這類細(xì)菌的大多數(shù)可被巴氏殺菌殺死，但菌體生長過程中產(chǎn)生的胞外酶（蛋白酶、脂酶）卻具有抗熱性，可以在巴氏消毒乳中保留其酶活性，進(jìn)而因酶的作用影響原料乳和終產(chǎn)品的風(fēng)味和質(zhì)量^[7]。對牛乳造成巨大危害的熱穩(wěn)定性酶類物質(zhì)一般分為兩大類：一類是熱穩(wěn)定性蛋白酶，另一類是熱穩(wěn)定性脂肪酶。

2.2.1熱穩(wěn)定性蛋白酶對牛乳的危害

     原料乳中的對熱穩(wěn)定性蛋白酶有兩類：牛乳自身的纖維蛋白溶酶(胞漿素)和由嗜冷菌產(chǎn)生的耐熱蛋白酶^[8]。嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶為影響乳及乳制品質(zhì)量的主要因素^[9]。

嗜冷菌產(chǎn)生的耐熱性蛋白酶具有耐高溫性，在殺菌中并不能完全失活，此類酶可以水解牛乳中蛋白質(zhì)。方海紅等人將嗜冷菌產(chǎn)生的耐高溫蛋白酶分為三種形式：胞內(nèi)酶、胞壁蛋白酶和胞外蛋白酶^[10]。這三種酶經(jīng)高溫處理后仍有較強的復(fù)性能力，沒有失活的部分蛋白酶，能夠重新恢復(fù)原來的活性。該殘留的蛋白酶可以分解κ-酪蛋白和α-酪蛋白，造成蛋白質(zhì)失去穩(wěn)定性，蛋白發(fā)生聚集并隨自身重力作用沉于底部，使乳清逐漸析出^[11]。同時該類蛋白酶在分解乳中蛋白時，還會使牛乳釋放出帶苦味的氨基酸和短肽，并且顏色褐變。此外，在加工過程中，這些耐熱性蛋白酶還會造成片式熱交換器的淤塞，對設(shè)備清理難度加大；嗜冷菌還會在設(shè)備的表面和膠墊上形成生物膜。

2.2.2熱穩(wěn)定性脂肪酶對牛乳的危害

     乳中的脂肪酶主要由原料乳的天然脂肪酶和嗜冷菌所產(chǎn)生的脂肪酶兩部分組成^[12]。

嗜冷菌所產(chǎn)生的脂肪酶具有良好的耐熱性。在經(jīng)138℃處理后，該脂肪酶活力仍能維持原先的一半；1981年Adams發(fā)現(xiàn)假單胞桿菌MC50產(chǎn)生的脂肪酶在100℃時D值達(dá)到63s^[13]；還有其它的研究者發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌產(chǎn)生的熱穩(wěn)定性脂肪酶150℃時的D值可達(dá)到了290s^[14]，可見該酶的耐熱性很強。這些耐熱的脂肪酶可以分解脂肪釋放出游離脂肪，游離出的脂肪能將脂肪球粘合在一起產(chǎn)生脂肪球簇，使牛乳的脂肪上浮；脂肪酶還可以對脂肪球膜進(jìn)行分解，使脂肪球出現(xiàn)聚集發(fā)生脂肪上浮^[15]。當(dāng)原料奶中嗜冷菌數(shù)量超過10⁶ cfu/ml，過多的蛋白酶和脂肪酶將導(dǎo)致UHT奶制品產(chǎn)生凝塊、發(fā)芽，并產(chǎn)生脂肪氧化味。

3.嗜冷菌的檢測與控制方法

3.1嗜冷菌的檢測方法

     對于嗜冷菌的檢測方法可以大體的分為2大類：傳統(tǒng)平板計數(shù)法和與現(xiàn)代技術(shù)結(jié)合法。這些方法仍具有一些局限性，目前尚需研究出省時、經(jīng)濟、高效的檢測方法。

3.1.1傳統(tǒng)平板計數(shù)法

     傳統(tǒng)平板計數(shù)法主要是：IDF Standard 101A對嗜冷菌培養(yǎng)溫度為4℃-6℃，培養(yǎng)時間為10d^[16]；IDF Standard 132A對嗜冷菌的培養(yǎng)溫度為21℃，培養(yǎng)時間為24h^[17]。前者的結(jié)果不如后者的準(zhǔn)確，后者比前者檢測速度快。紀(jì)振杰等通過使用標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法與3M 細(xì)菌總數(shù)測試紙片法檢測原料乳中嗜冷菌數(shù)的比較實驗，確定3M 細(xì)菌總數(shù)測試紙片法為快速、精確的檢測嗜冷菌數(shù)的方法^[18]。

3.1.2現(xiàn)代檢測技術(shù)

      由于中國乳品產(chǎn)業(yè)起步晚，所以國內(nèi)現(xiàn)代檢測技術(shù)應(yīng)用沒有國外那么普遍。與現(xiàn)代技術(shù)結(jié)合的檢測方法主要有rDNA核酸序列、熒光標(biāo)記物^[29]、ELISA法^[20]、肽核酸探針等。任靜等人通過對酶活性的檢測來建立嗜冷菌與產(chǎn)物耐熱性脂肪酶的關(guān)系，進(jìn)而得到嗜冷菌數(shù)^[21]。由于現(xiàn)代檢測技術(shù)需要昂貴的儀器設(shè)備和實驗藥品，在乳制品工業(yè)中尚不能普遍使用。

3.2嗜冷菌的控制方法

     嗜冷菌的動態(tài)增加與耐熱蛋白酶和耐熱脂肪酶活力變化趨勢大致相同，對牛乳的貨架期產(chǎn)生影響^[22]。由此可見控制嗜冷菌的數(shù)量和耐熱酶是非常有必要的。目前，國內(nèi)外對嗜冷菌的有效抑制方法還報道的不多，有利用CO₂來進(jìn)行減少嗜冷菌數(shù)量的，有利用化學(xué)殺菌劑的，還有添加金屬離子的。牛乳中嗜冷菌的數(shù)量可以從牛乳加工前和加工過程兩個階段采取控制措施。

3.2.1牛乳加工前。原料乳中本身含有的嗜冷菌極少，主要是外源嗜冷菌的侵染。3.2.1.1注意消毒。在原料乳采集時一定要注意對周圍的環(huán)境、牛的乳房和乳頭、擠奶器具、儲運工具等徹底消毒。

3.2.1.2縮短加工前牛乳的儲藏時間。

3.2.1.3深度冷藏。溫度較低時，嗜冷菌的生長表現(xiàn)較長的延滯期和世代間隔，原料奶中常見嗜冷菌在4℃時平均代時為8～9 h^[23]。

3.2.1.4添加安全防腐劑。如添加聚磷酸鹽、乳酸鏈球菌素（Nisin）、0.5%的殼寡糖等^[8]。

3.2.1.5利用無害技術(shù)。如超聲波、電離輻照保鮮、脈沖電場殺菌、添加乳過氧化氫酶體系等。

3.2.2牛乳加工過程。

3.2.2.1建立健全HACCP和GMP。在生產(chǎn)的過程中要嚴(yán)格按照HACCP和GMP的要求，嚴(yán)格清洗管道。

3.2.2.2滅菌時調(diào)控時間和溫度。如巴氏預(yù)處理，嗜冷菌的胞外蛋白酶和脂肪酶具有不能耐受中溫性，在55℃下5-6 min這些酶很容易破壞；還有人利用低溫鈍化方法(LTI)來提高UHT乳的貨架期，將超高溫滅菌（140℃、5 s）處理后的牛奶冷卻至60℃，保持5 min，可有效地鈍化嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶^[24]。

4.小結(jié)

    原料乳生產(chǎn)中嗜冷菌污染是常見的問題之一，嗜冷菌還影響牛乳的品質(zhì)，使牛乳的發(fā)生腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。這一原因的主要是嗜冷菌的耐熱酶導(dǎo)致的。在實際的生產(chǎn)過程中一定要樹立防止細(xì)菌污染的意識，在生產(chǎn)加工的各個環(huán)節(jié)注意良好的操作規(guī)范和加強監(jiān)管。要最終解決這個問題，還需要進(jìn)一步研究清楚嗜冷菌及其耐熱酶在牛乳中的作用機制。

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